ヒト細胞でのコンビナトリアルな遺伝子スクリーニングを目的とするAsCas12aの最適化

Cas12a RNA誘導型エンドヌクレアーゼは、単一の転写物として発現した複数のガイドRNAをプロセシングして標的DNAを切断することができるため、多重遺伝子擾乱の有望なツールとなっている。しかし、Cas12a RNA誘導型エンドヌクレアーゼは活性が低く、十分に検証されたプールスクリーニングのツールキットが存在しないことから、その普及はCas9法に後れを取っている。今回我々は、ヒト細胞でのプール化コンビナトリアル遺伝子スクリーニングを目的とするAcidaminococcus由来の強化型Cas12a（enAsCas12a）の最適化を行ったことを報告する。我々は、数千種類のガイドの活性を評価することでオンターゲットの設計ルールを改良し、特異性の低いガイドを予測して排除するためのオフターゲットルールの網羅的セットを開発した。我々はまた、野生型の塩基配列を置換することができる38種類の直接反復バリアントを特定した。我々は、この最適化AsCas12aツールキットをOVCAR8がん細胞とA375がん細胞での合成致死性スクリーニングによって検証し、MARCH5とWSB2との相互作用を見いだした。最後に、enAsCas12aはゲノム規模のドロップアウトスクリーニングでの性能がCas9と同等であるが、ライブラリーサイズが大幅に小さくて済むことが示されたことから、難しいモデルでのスクリーニングが容易になると考えられる。