天然型および改変型CRISPRヌクレアーゼの超並列動態プロファイリング

改変型のSpCas9とAsCas12aは、野生型（wt）Cas9と比較してオフターゲットゲノム部位の切断が少ない。しかし、その忠実度、機構、切断結果を明らかにするには、誤対合標的DNAの体系的なプロファイリングが必要となる。本論文では、ガイドRNAに対するミスマッチ、挿入、欠失を含む1万種類以上の標的について切断動態と時間分解切断産物を測定する超並列プラットフォーム、NucleaSeq（nuclease digestion and deep sequencing）を紹介する。我々は、同一の標的ライブラリーで切断速度と結合特異性を組み合わせることにより、5種類のSpCas9バリアントとAsCas12aをベンチマーク評価した。このデータセットから構築した生物物理学的モデルにより、オフターゲット切断に関する機構的知見が得られた。改変型Cas9、特にCas9-HF1は、wtCas9と比べて切断特異性が劇的に向上したが、結合特異性は向上が見られなかった。意外にも、AsCas12aの切断特異性はwtCas9とほとんど変わらなかった。初期DNA切断部位と末端のトリミングは、ヌクレアーゼ、ガイドRNA、誤対合ヌクレオチドの位置によって変化した。より広く言うと、NucleaSeqは、改変型ヌクレアーゼと天然型ヌクレアーゼの特異性と切断結果に関する迅速で定量的な体系的比較を可能とするものである。