改変V-K型CRISPR関連トランスポザーゼによる正確なカットアンドペースト式のDNA挿入

CRISPR関連トランスポザーゼ（CAST）は、RNAでプログラムされたゲノム上の位置へ、何キロ塩基にも及ぶDNAを組換えによらずに挿入することを可能にしている。しかし、V-K型CASTの有用性は、高率のオフターゲット組み込みと、望ましい単純なカーゴ挿入物と望ましくないプラスミド共導入生成物との混合物を生じるトランスポジション機構によって妨げられている。今回、この2つの制約を克服するために、組み込み生成物の純度とゲノム規模の特異性が改善された新たなCASTを作製した。我々はまず、ニックを導入するホーミングエンドヌクレアーゼとTnsBの融合体（HELIXと命名）を作製し、DNAドナー上のカーゴの切り出しに必要な5′ニック導入能を回復させた。HELIXは、ゲノム標的でのロバストな組み込み効率を保ちながら、最高99.4％という単純挿入物純度でカットアンドペースト式のDNA挿入を可能にした。そのオンターゲット特異性は標準的なCASTを大幅に上回るが、我々は選択的でゲノム規模の組み込みをさらに調節する複数の新規因子を見いだした。また、HELIXを他のタイプのV-K型オルソログに拡張し、ヒト細胞の環境でHELIXを介した組み込みの実現可能性を実証した。