CRISPR RNA誘導型アデニン塩基エディターのゲノム規模の標的特異性

アデニン塩基エディターは、ヒト細胞および動植物でアデニンからグアニンへの一塩基変換を効率的かつ選択的に行い、点変異を誘導または修正することができる。本論文では、改変版のDigenome-seqについて示す。Digenome-seqは、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）が誘導する二本鎖切断を全ゲノム配列解読法で発見し、アデニン塩基エディターのゲノム規模の標的特異性を評価するためのin vitro法である。我々は、アデニン脱アミノ反応生成物のイノシンを含む部位で二本鎖切断を生じさせるために、アデニン塩基エディター7.10タンパク質・ガイドRNA複合体と、エンドヌクレアーゼVあるいはヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼVIIIの組み合わせのいずれかを用いてヒトゲノムDNAをin vitroで処理した。Digenome-seqは、アデニン塩基エディターの置換頻度0.1％以上のオフターゲット部位を検出した。アデニン塩基エディター7.10、シトシン塩基エディターBE3、および非改変CRISPR関連タンパク質9（Cas9）は、別のオフターゲット部位を認識する場合が多いことが分かり、それらのゲノム規模の特異性を個別に評価する必要性が明らかになった。また、選択的塩基配列解読により、アデニン塩基エディターの組み立て済みリボ核タンパク質、改変ガイドRNA、およびSniper/Cas9の使用によってヒト細胞でのアデニン塩基エディターのオフターゲット活性が抑制されることも示された。