ハイブリッドssDNA修復鋳型と低分子カクテルによる初代細胞の高収量なゲノム改変

CRISPRを介した部位特異的な導入遺伝子の挿入効率を、Cas9標的配列（CTS）を有する高濃度の二本鎖DNA（dsDNA）を用いた相同組換え修復（HDR）によって高めることは、初代細胞に害を与える場合がある。今回我々は、CTSを組み込んだ低毒性の一本鎖DNA（ssDNA）HDR鋳型を開発し、ノックイン効率と収量をdsDNA CTSの平均2～3倍程度に増強した。HDRを増強する低分子を組み合わせて用いることで、ノックイン効率は平均でさらに2～3倍ほど向上させることができた。今回の方法はさまざまな標的座位やノックイン構築物、初代ヒト細胞型で機能し、HDR効率は80～90％以上に達した。メンデル疾患に関連するIL2RAおよびCTLA4変異に関して、病原性遺伝子バリアントのモデル化と遺伝子置換の両方で、この方法の応用性が実証された。また、適正製造規範（Good Manufacturing Practice；GMP）に適合する非ウイルス的なキメラ抗原受容体T細胞の製法を開発したところ、ノックイン効率（46～62％）と収量（1.5 × 10⁹個以上の改変細胞）が従来法を上回った。