Research Abstract
Cas9および単一ガイドRNAを発現する環状プラスミドの前核注入による変異マウスの作製
Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA
2013年11月27日 Scientific Reports 3 : 3355 doi: 10.1038/srep03355
CRISPR/Casによるゲノム編集の哺乳類細胞での成功が実証され、さらに、マウス受精卵へのヒト化Cas9（hCas9）mRNAおよび単一ガイドRNA（sgRNA）の注入による変異マウス作製への応用が報告された。今回我々は、マウス受精卵へhCas9およびsgRNAを発現する環状プラスミドを注入することで、1か月以内に変異マウスを得た。Cetn1座位を標的とした場合、仔の58.8%（10/17）は変異を有しており、そのうちの6匹はホモ接合性変異であった。また異なる2座位を標的とするプラスミドを共注入すれば、変異仔マウス3匹のうち2匹において、これらの座位間の領域を除去することができた。さらに、Prm1座位においても効率的な変異誘発を観察した。なおCRISPR/Casプラスミドによる変異を保持する仔46匹のうち、2匹のみがhCas9トランスジーンを有していた。hCas9/sgRNA複合体を発現する環状プラスミドの前核注入は、標的変異マウス作製のための、迅速、簡単かつ再現可能な方法である。
増子 大輔1,2, 藤原 祥高1, 佐藤 裕公1,3, 宮田 治彦1,3, 磯谷 綾子1,3 & 伊川 正人1,2,3,4
- 大阪大学 微生物病研究所
- 大阪大学 大学院医学系研究科
- 大阪大学 免疫学フロンティア研究センター
- 大阪大学 大学院薬学研究科
CRISPR/Cas mediated genome editing has been successfully demonstrated in mammalian cells and further applications for generating mutant mice were reported by injecting humanized Cas9 (hCas) mRNA and single guide RNA into fertilized eggs. Here we inject the circular plasmids expressing hCas9 and sgRNA into mouse zygotes and obtained mutant mice within a month. When we targeted the Cetn1 locus, 58.8% (10/17) of the pups carried the mutations and six of them were homozygously mutated. Co-injection of the plasmids targeting different loci resulted in the successful removal of the flanked region in two out of three mutant pups. The efficient mutagenesis was also observed at the Prm1 locus. Among the 46 offspring carrying CRISPR/Cas plasmid mediated mutations, only two of them carried the hCas9 transgene. The pronuclear injection of circular plasmid expressing hCas9/sgRNA complex is a rapid, simple, and reproducible method for targeted mutagenesis.
