Research Abstract
ゼブラフィッシュにおけるCRISPR/Cas9システムを用いた外来遺伝子の精巧なゲノム挿入法
Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish
2015年3月5日 Scientific Reports 5 : 8841 doi: 10.1038/srep08841
CRISPR/Cas9システムは、ゼブラフィッシュを含む、さまざまなモデル生物に利用できる強力なゲノム編集技術である。CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム改変により標的遺伝子を破壊したゼブラフィッシュ（ノックアウトゼブラフィッシュ）を容易に作製できる。最近、非相同末端結合修復を介した外来遺伝子のゲノム挿入がゼブラフィッシュで報告されたが、この挿入法では標的ゲノム部位と挿入された遺伝子の連結部にさまざまな変異が見られた。したがって、標的ゲノム部位での正確なゲノム改変は達成されていない。本研究において標的ゲノム部位と同じ短い相同配列（10–40 bp）を持つドナーベクターを用いた効率的で精巧なCRISPR/Cas9によるゲノム改変を報告する。我々は、標的遺伝子（チロシナーゼおよびkrtt1c19e）の遺伝子座にインフレームで外来のレポーター遺伝子である mCherryあるいはeGFPを高効率で挿入することに成功した。eGFP遺伝子の両側に短い相同配列とCas9切断部位を導入すると、バックボーンベクターの配列を含まずに正確にインフレームで外来遺伝子が挿入されることがわかった。そのうえ、この正確なゲノム改変は次世代に受け継がれることも確認した。この簡単な方法によりゼブラフィッシュにおいて標的遺伝子への精巧なノックインが可能になる。
Yu Hisano, Tetsushi Sakuma, Shota Nakade, Rie Ohga, Satoshi Ota, Hitoshi Okamoto, Takashi Yamamoto & Atsuo Kawahara
Corresponding Authors
The CRISPR/Cas9 system provides a powerful tool for genome editing in various model organisms, including zebrafish. The establishment of targeted gene-disrupted zebrafish (knockouts) is readily achieved by CRISPR/Cas9-mediated genome modification. Recently, exogenous DNA integration into the zebrafish genome via homology-independent DNA repair was reported, but this integration contained various mutations at the junctions of genomic and integrated DNA. Thus, precise genome modification into targeted genomic loci remains to be achieved. Here, we describe efficient, precise CRISPR/Cas9-mediated integration using a donor vector harbouring short homologous sequences (10–40 bp) flanking the genomic target locus. We succeeded in integrating with high efficiency an exogenous mCherry or eGFP gene into targeted genes (tyrosinase and krtt1c19e) in frame. We found the precise in-frame integration of exogenous DNA without backbone vector sequences when Cas9 cleavage sites were introduced at both sides of the left homology arm, the eGFP sequence and the right homology arm. Furthermore, we confirmed that this precise genome modification was heritable. This simple method enables precise targeted gene knock-in in zebrafish.
