Research Abstract
CRISPR/Cas9系を用いたニワトリでの標的特異的変異導入
Targeted mutagenesis in chicken using CRISPR/Cas9 system
2016年4月6日 Scientific Reports 6 : 23980 doi: 10.1038/srep23980
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CRISPR/Cas9系は、家畜を含めたさまざまな生物におけるゲノム編集の簡便かつ強力なツールである。しかし、家禽では受精卵に用いることが困難であったため、この系は適用されてこなかった。今回我々は、ニワトリにおいてCRISPR/Cas9による遺伝子ターゲッティングを行ったことを報告する。培養ニワトリ始原生殖細胞（PGC）に、Cas9、単鎖ガイドRNA、薬剤耐性遺伝子をコードする環状プラスミドをトランスフェクションし、その後一過性の抗生物質選択を行うことで、2つの卵白遺伝子（ovalbuminおよびovomucoid）に効率的（90％以上）に変異が導入された。CRISPRにより変異を導入したovomucoidを持つPGCをレシピエントニワトリ胚に移植し、3羽の生殖細胞系列キメラ雄ニワトリ（G0）を樹立した。3羽全ての雄キメラニワトリがドナー由来の変異型ovomucoid精子を有しており、その中のドナー由来精子の寄与率が高い2羽の後代 (G1)では、約半分が変異型ovomucoidをヘテロ接合性で持っていた。さらに、G1の変異型ニワトリの交配により、変異型ovomucoidをホモ接合性で持つ産子（G2）が得られた。以上のことからこれらの結果は、CRISPR/Cas9系がニワトリにおける簡便で効率的な遺伝子ターゲッティング方法になることを示している。
Corresponding Authors
The CRISPR/Cas9 system is a simple and powerful tool for genome editing in various organisms including livestock animals. However, the system has not been applied to poultry because of the difficulty in accessing their zygotes. Here we report the implementation of CRISPR/Cas9-mediated gene targeting in chickens. Two egg white genes, ovalbumin and ovomucoid, were efficiently (>90%) mutagenized in cultured chicken primordial germ cells (PGCs) by transfection of circular plasmids encoding Cas9, a single guide RNA, and a gene encoding drug resistance, followed by transient antibiotic selection. We transplanted CRISPR-induced mutant-ovomucoid PGCs into recipient chicken embryos and established three germline chimeric roosters (G0). All of the roosters had donor-derived mutant-ovomucoid spermatozoa, and the two with a high transmission rate of donor-derived gametes produced heterozygous mutant ovomucoid chickens as about half of their donor-derived offspring in the next generation (G1). Furthermore, we generated ovomucoid homozygous mutant offspring (G2) by crossing the G1 mutant chickens. Taken together, these results demonstrate that the CRISPR/Cas9 system is a simple and effective gene-targeting method in chickens.
