Research Abstract
CRISPR/Cas9ゲノム編集の最適化による植物の非生物的ストレス応答の改変
Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing to modify abiotic stress responses in plants
2016年5月26日 Scientific Reports 6 : 26685 doi: 10.1038/srep26685
CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集は植物ゲノムの改変に用いることができるが、この編集法をさまざまな植物種に有用なものとするには、特異性および応用性の一層の向上が必要である。今回、tru-gRNA（truncated-gRNA；長さの短いgRNA）とCas9との組み合わせによって行われるゲノム編集を利用することにより、シロイヌナズナのプロトンポンプOST2に関して、オフターゲット効果を生じずに新たなアレルが得られた。Cas9およびtru-gRNAの発現を追跡することにより、CRIPSR/Cas9形質転換植物に新たに生じた変異が、構成的プロモーターの利用によって32.8％という高い平均変異率で検出され、オフターゲット効果は認められなかった。Cas9の核移行シグナルを減少させると、変異率は低下した。一方、分裂組織および生殖組織に特異的なプロモーターで発現制御するtru-gRNA Cas9カセットによってシロイヌナズナの遺伝性変異率は上昇し、生殖細胞系列での高発現によって両アレル変異が生じることが示された。OST2に関して得られた新しい変異アレルは、環境条件に応答した気孔閉鎖の変化を示した。以上の結果は、最適化された植物CRISPR/Cas9システムを用いて、植物の機能改良を目的とした分子育種でのさらなる応用性を示唆している。
Corresponding Authors
Genome editing using the CRISPR/Cas9 system can be used to modify plant genomes, however, improvements in specificity and applicability are still needed in order for the editing technique to be useful in various plant species. Here, using genome editing mediated by a truncated gRNA (tru-gRNA)/Cas9 combination, we generated new alleles for OST2, a proton pump in Arabidopsis, with no off-target effects. By following expression of Cas9 and the tru-gRNAs, newly generated mutations in CRIPSR/Cas9 transgenic plants were detected with high average mutation rates of up to 32.8% and no off-target effects using constitutive promoter. Reducing nuclear localization signals in Cas9 decreased the mutation rate. In contrast, tru-gRNA Cas9 cassettes driven by meristematic- and reproductive-tissue-specific promoters increased the heritable mutation rate in Arabidopsis, showing that high expression in the germ line can produce bi-allelic mutations. Finally, the new mutant alleles obtained for OST2 exhibited altered stomatal closing in response to environmental conditions. These results suggest further applications in molecular breeding to improve plant function using optimized plant CRISPR/Cas9 systems.
