【遺伝子治療】CRISPR/Cas9法による遺伝コード中の一塩基の編集
Nature
遺伝コード中の1個の塩基に狙いを定めて修正する方法が改良され、ゲノム配列におけるランダムな挿入や欠失を起こさなくなったことを報告する論文が掲載される。この新しい「一塩基編集法」は、他の2種類のタンパク質と結合するように操作された組換えCRISPR/Cas9タンパク質を用い、現行の方法より一塩基の変異を修正する効率が高く、培養細胞に用いて遅発性アルツハイマー病や乳がんなどの疾患に関連する一塩基変異を修正することに成功している。
大部分の遺伝性疾患は、1個のヌクレオチドの変異（点変異）によって生じる。ゲノム編集に現在幅広く用いられているCRISPR/Cas9法は、DNAの2本の鎖を切断し、標的のDNA塩基配列に二本鎖切断を形成する。しかし、標準的なCRISPR/Cas9法を1個のヌクレオチドの修正に用いると、通常は効率が悪く、主に二本鎖DNA切断に対する細胞応答の結果として、標的部位にランダムな挿入や欠失（「インデル」と総称される）を生じることが多い。
今回、David Liuたちは、インデルの頻度を最小限に抑えつつ点変異を修正する効率を高めるため、Cas9タンパク質を修飾してDNAの2本鎖切断を起こさずに標的DNA配列と結合するようにした。Liuたちは、塩基修飾酵素（APOBEC1）をCas9に付加することで、シトシン（C）をチミン（T）の塩基対形成特性を有するウラシル（U）に直接変換した。そして、Liuたちは、こうして編集された塩基対を細胞内で永続させるため、第3のタンパク質を用いて正常な細胞のDNA修復過程を操作して、標的としたC:G塩基対をT:A塩基対に変換した。Liuたちは、この一塩基編集システムを用いて、マウスとヒトの細胞株においてヒトの疾患に関係するさまざまな点変異を効率的に修正し、インデルの形成を最小限に抑えることができることを明らかにした。
また、同時掲載される別の2編の論文は、CRISPRによるゲノム編集にCas9の代わりに使えるCpf1酵素の機構と構造に関する新たな情報をもたらしている。Emmanuelle Charpentierたちは、Cpf1がCas9と異なり、選択的ゲノム編集に必要なRNAプロセシング活性とDNA切断活性を発揮でき、配列特異的なゲノム操作とサイレンシングの新たな方法に道を開く可能性のあることを明らかにした。また、Zhiwei Huangたちの論文では、RNAと結合したCpf1タンパク質の結晶構造について報告されており、Cpf1がRNAと結合すると、Cpf1の形状がどのように変化するのかが説明されている。
An improved method for targeting and modifying single letters of the genetic code, without introducing random insertions and deletions into the genome, is reported in a paper published in Nature. The new ‘base editing’ method, which uses a modified CRISPR/Cas9 protein engineered to work with two other proteins, is more efficient at correcting single base mutations than existing methods, and has been used in cultured cells to successfully reverse single base mutations that are associated with diseases, including late-onset Alzheimer’s and breast cancer.
Most genetic diseases arise from mutations to a single nucleotide (point mutations). The CRISPR/Cas9 method currently widely used for genome editing involves cutting both strands of DNA, forming a double-stranded break in the target DNA sequence. However, when used to correct a single nucleotide, the standard CRISPR/Cas9 method is usually inefficient, and frequently introduces random insertions or deletions (collectively known as indels) at the target location, mainly as a result of the cellular response to a double-stranded DNA break.
To increase the efficiency of correcting point mutations while minimizing the frequency of indels, David Liu and colleagues modified the Cas9 protein so that it no longer cuts both strands of DNA, but can still bind to a target DNA sequence. By attaching a base modifying enzyme (APOBEC1) to Cas9, the authors were able to directly convert cytosine (C) to uracil (U), which forms base pairs as thymine (T). To cause the edited base pair to become permanent in cells, the authors used a third protein to manipulate normal cellular DNA repair processes, resulting in the conversion of a target C:G base pair to a T:A base pair. The authors show that their base editing system can be used to efficiently correct a variety of point mutations relevant to human disease in mouse and human cell lines, with minimal indel formation.
Two other studies published in Nature provide new information on the mechanism and structure of the Cpf1 enzyme, which can be used as an alternative to Cas9 in CRISPR-mediated genome editing. Emmanuelle Charpentier and colleagues show that Cpf1, unlike Cas9, can perform both the RNA processing and DNA cleavage activities required for targeted genome editing, possibly opening up new avenues for sequence-specific genome engineering and silencing. In a separate paper, Zhiwei Huang and colleagues report the crystal structure of Cpf1 protein bound to RNA, and describe how Cpf1 shape changes when bound.
doi: 10.1038/nature17946
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